δ-连环素在糖尿病大鼠海马神经元中的表达

【摘要】  目的 观察δ-连环素在大鼠糖尿病模型海马神经元中的表达特征。方法 根据实验需要将大鼠随机分成糖尿病组、正常对照组和缓冲剂组。按45 mg/ kg一次性尾静脉注射链脲佐菌素(溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液)诱发糖尿病,缓冲剂组只给予等量的缓冲液。应用免疫组织化学方法观察海马神经元的形态结构变化，并应用计算机图像分析技术检测δ-连环素在各组中的定量表达。结果 糖尿病组大鼠海马神经元中δ-连环素表达明显低于正常对照组和缓冲剂组，在海马齿状回减少尤为明显。结论 糖尿病可下调大鼠海马神经元中δ-连环素的表达。

【关键词】  δ-连环素;糖尿病;海马;大鼠;免疫组织化学

Abstact：Objective To investigate the characteristics of the expression of δ-catenin in diabetic rat hippocampal neurons. Methods The rats were randomized into diabetic, normal control and buffer groups. The rats in the diabetic group were injected with a single dose of 45 mg·kg of STZ (dissolved in 0.1 mol/L sodium citrate buffer) via the caudal vein to induce diabetes mellitus, and the animals in the buffer group received the same dose of sodium citrate buffer alone. The morphological changes of the hippocampal neurons were observed by immunohistochemical method and the quantitative expression of δ-catenin in each group was determined by computer-assisted image analysis system. Result Immunohistochemical method and quantitative assay revealed that the expression of δ-catenin in the diabetic group was the lowest in the three groups, particularly in the dentate gyrus (DG). Conclusion The diabetic functional disorders of the central nervous system may downregulate the expression of δ-catenin.

Key words：δ-catenin; diabetes; hippocampus; rat; immunohistochemistry

糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，可引起认知功能障碍及大脑的神经生理和结构改变[1-2]。海马是与脑高级功能相关的重要结构，在糖尿病患者中易受到损害，表现为更易发生中风、痴呆和认知减退[3]。

δ-连环素属于P120-catenin蛋白家族，特异性地表达在神经元[4]。研究发现δ-连环素过表达能诱导细胞形成树突状突起，并增加原代海马细胞中树突的形成[5]。已有报道δ-连环素基因变异小鼠表现出严重的学习障碍、突触可塑性降低和突触成分的改变。糖尿病患者认知功能减退的机制至今不明，在糖尿病动物海马神经元中δ-连环素的表达变化也鲜有报道。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型制备 SD雄性大鼠，体重 260～300 g，徐州医学院实验动物中心提供。随机分成正常对照组、缓冲剂组和糖尿病组(n=9)。按文献[6]方法，一次性尾静脉注射链脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液),缓冲剂组只给予等量的缓冲液。3天后测血糖，血糖>16.7 mmol/L,饮水及尿量明显增多为造模成功。造模成功后常规饲养60天，中间不进行胰岛素干预，也不进行糖尿病饮食控制，造模后每周监测血糖。每组取9只大鼠5%茂巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏先灌注100 ml的生理盐水后灌注4%多聚甲醛〔0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.3配制〕固定30 min。动物静置于4℃冰箱3 h后取大脑，用上述固定液后固定约6 h(4℃)。并修取含海马脑段，经20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片机切片，片厚20 μm。每个动物均依次等距离间隔选取切片,贴片。

1.2 血糖测定 造模3天和取材前内眦静脉取血测血糖,血糖测定采用葡萄糖氧化酶法血糖试剂盒。

1.3 SABC法免疫细胞化学反应 切片经：①300 mg/L H2O2 20 min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封闭，37℃ 30 min;③δ-连环素1∶200，4℃ 18 h后，室温孵育6 h;④生物素标记IgG 1∶300，室温孵育2 h;⑤SABC复合物1∶300，室温孵育1 h;⑥3 mg/L H2O2和5 mg/L DAB显色，显微镜下观察，出现阳性颗粒后终止反应。反应步骤③～⑥过程中，每步后均用0.01 mol/L PBS，pH 7.3漂洗3次，每次10 min。切片经乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

1.4 海马齿状回DG区δ-连环素阳性反应产物吸光度测定分析 每只动物各取进行过SABC反应的不相邻切片6张(间隔20 μm)。400倍的高倍镜下，在海马DG区随机选取10个视野，采用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统对各组δ-连环素反应阳性的细胞进行吸光度的半定量分析。实验数据用t检验进行统计处理。

1.5 统计学方法 所有结果用SPSS 12.0分析。各组之间差异用单因素方差分析检验。再用Student-Newman-Keuls进行两两比较，结果用±s表示。P<0.05表示在统计学上有显著性差异。

2 结 果

2.1 大鼠海马区δ-连环素的表达 结果显示δ-连环素免疫反应阳性产物呈棕黄色细颗粒状，在海马各亚区的神经元胞质和胞膜中均有表达。显微镜下观察到，正常对照组(图1B，E)和缓冲剂组(图1C、F)大鼠海马神经元中的δ-连环素免疫反应的阳性颗粒色深密集，均明显高于糖尿病组(图1A、1D)。在海马齿状回(DG区)δ-连环素主要表达于颗粒层和颗粒下层，少量表达于门区。大鼠海马齿状回δ-连环素的表达在糖尿病组减少更加明显。正常对照组和缓冲剂组间大鼠海马神经元中δ-连环素的`免疫反应差异不明显。

图1 δ-连环素catenin在各组大鼠海马神经元中表达

其中A(×40)和D(×400)为糖尿病组，B(×40)和E(×400)为正常对照组，C(×40)和F(×400)为缓冲剂组

2.2 海马齿状回(DG)δ-连环素阳性反应产物吸光度测定分析 正常组和缓冲剂组海马神经元中δ-连环素吸光度(absorbance)(A)无明显差异，但分别高于糖尿病组304%和291%，其差别具有显著性意义。见表1。表1 各组大鼠海马齿状回神经元中δ-连环素表达的定量分析结果

3 讨 论